A titulação de anticorpos neutralizantes contra o vírus rábico (AcN) pós-imunização é um parâmetro aceito como indicador de eficácia da vacina e do sucesso do processo de imunização. Este estudo descreve um teste de neutralização realizado em cultura de células, analisado através da técnica de citometria de fluxo. Diluições seriadas de amostras de soro foram misturadas in vitro com vírus rábico e adicionados a células BHK-21. Após incubação de 24 h, as células foram individualizadas por tratamento com tripsina, fixadas e permeabilizadas com p-formaldeído e coradas com conjugado específico. A porcentagem de inibição da infecção viral causada pelos anticorpos específicos presentes nas amostras de soro foi determinada em citômetro de fluxo Beckton & Dickinson FACSCalibur® e comparada com um soro de referência internacional. Os títulos de AcN foram determinados por extrapolação. Os níveis de correlação (r) entre os títulos obtidos com CF e SFIMT foi de 0.7712 (p < 0,001), e entre CF e ELISA de 0,6702 (p < 0,001). Os resultados indicam que a CF pode ser utilizada na análise de títulos de anticorpos neutralizantes em amostras de soro, com a vantagem de ser um método automatizado. No entanto, devem ser realizados novos estudos, comparando a CF com as técnicas consideradas como padrão ouro, para que os valores reais de Sensibilidade e Especificidade sejam determinados.

The determination of the rabies neutralizing antibody (VNA) response after immunization against rabies is an acceptable index of the efficacy of a vaccine and a successful treatment. Several tests have been developed in attempt to improve the assessment of VNA, from mice inoculation to cell-culture fluorescence inhibition tests. All of them, however, present special difficulties in terms of reading or accuracy. The present study describes a neutralization test performed in cell-culture appraised by flow cytometry (FC). Serial dilutions of the serum samples were mixed in vitro with rabies virus before the addition of BHK-21 cells. After 24h-incubation, cells were released by trypsin treatment, fixed and permeabilized with a p-formaldehyde solution and stained with a rabies virus nucleocapsid protein-specific antibody conjugate. The percentage of virus infection inhibition caused by specific antibodies present in the serum were evaluated in a Beckton & Dickinson FACSCalibur® flow cytometer. A correlation curve between the IU/ml content and the percentage of infective inhibition was built with a reference serum and the VNA titers of serum samples were obtained by extrapolation. Titers obtained by FC and standard test showed an effective pairing results (p < 0.01), with a correlation coefficient (r) = 0.7. These results permit to envisage the FC as a suitable technique to evaluate VNA in sera from immunized animals and likely in human serum samples. Nevertheless, new studies comparing FC to gold-standard techniques are required for determining the FC values of Sensibility and Specificity .

A raiva bovina, transmitida principalmente pelo morcego hematófago Desmodus rotundus, é endêmica em várias regiões do Brasil, com um crescente número de casos sendo registrados anualmente. O controle desta infecção em bovinos é feito pelo controle de colônias de morcegos hematófagos e pela vacinação dos rebanhos. Embora as vacinas inativadas sejam mais seguras e mais estáveis que as vacinas atenuadas, estas últimas são ainda amplamente utilizadas em muitas regiões do país, por se acreditar que confiram imunidade mais duradoura. Neste estudo, foram comparadas as respostas anticórpicas de dois grupos de bovinos imunizados com uma vacina atenuada e uma inativada disponíveis comercialmente. Os anticorpos anti-rábicos neutralizantes (AcN) foram titulados pela técnica de soroneutralização em cultura de células BHK-21, enquanto que os níveis de anticorpos anti-rábicos totais (IgG) foram avaliados pela técnica de ELISA, por um período de 180 dias. A vacina inativada induziu a soroconversão (AcN 3 0,5 UI/ml) em 100% dos animais no dia 30, mantendo-se assim até o 150o dia; no dia 180, 87% dos animais ainda mostravam-se com títulos de AcN 3 0,5 UI/ml. Neste grupo, os níveis de IgG anti-rábicas foram semelhantes aos de AcN. A vacina atenuada, no entanto, induziu títulos de AcN e de IgG significantemente menores que os encontrados com a vacina inativada, com consequente diminuição da taxa de soropositividade. Além disso, ao contrário do verificado com a vacina inativada, o perfil de AcN não teve paralelismo com o de anticorpos IgG quando soros foram testados pela técnica de soroneutralização e pelo ELISA, respectivamente.

Despite the absence of current official reports showing the number of cattle infected by rabies, it is estimated that nearly 30,000 bovines are lost each year in Brazil. In order to minimize the important economic losses, control of the disease is achieved by eliminating bat colonies and by herd vaccination. In this study, we compare the antibody response in cattle elicited by vaccination with an attenuated ERA vaccine (AEvac) and an inactivated-adjuvanted PV (IPVvac) vaccine. The antibody titers were appraised by cell-culture neutralization test and ELISA, and the percentage of seropositivity was ascertained for a period of 180 days. IPVvac elicited complete seropositivity rates from day 30 to day 150, and even on day 180, 87% of the sera showed virus-neutralizing antibody titers (VNA) higher than 0.5IU/ml. There were no significant differences between the VNA titers and seropositivity rates obtained with IPVvac in the two methods tested. AEvac, however, elicited significantly lower titers than those observed in the group receiving inactivated vaccine. In addition, the profiles of antirabies IgG antibodies, evaluated by ELISA, and VNA, appraised by cell-culture neutralization test, were slightly different, when both vaccines were compared.

O método imunoenzimático (ELISA) foi adaptado para quantificar anticorpos anti-rábicos em soros de pessoas previamente imunizadas. Foi utilizado como antígeno, partículas virais purificadas inativadas, e como conjugado, Proteína A conjugada à peroxidase. Foram testados soros de pessoas vacinadas com vacina de cultura celular ou com vacina produzida em cérebro de camundongo. Os resultados foram comparados a aqueles obtidos pela prova de soroneutralização em cultura celular. A média e o desvio padrão foram calculados para 126 soros negativos e para 73 soros de pessoas vacinadas mas com título menor que 0,5 UI/ml. Foi proposta a adoção de uma região de dúvida, levando a uma diminuição de resultados falso positivos. A sensibilidade, especificidade e concordância do teste foram respectivamente : 87,5%, 92,4% e 88,5%. Não foram observadas diferenças significativas quando comparados os resultados dos indivíduos vacinados com uma ou outra vacina utilizada. Grande parte dos resultados discordantes no ELISA e soroneutralização ocorreram em soros coletados após a primeira dose de vacina, e se deveu provavelmente a presença de IgM nas amostras, detectados somente pela soroneutralização. O ELISA pode ser utilizado como um teste independentemente da vacina que foi empregada.

An indirect ELISA for determination of post-vaccination rabies antibody was applied. Purified rabies virus was used as antigen to coat plates, and staphylococcal protein A linked with horseradish peroxidase was used for detecting IgG antibody in human sera. Sera from humans, vaccinated with cell-culture vaccine or suckling-mouse-brain vaccine, were examined. ELISA results were compared to those obtained from the virus neutralization test. The mean and standard deviation of OD were determined for 126 negative sera (pre-vaccination) and for 73 sera from vaccinated persons showing antibody titers lower than 0.5 IU/ml. Results were defined as ELISA -positive, -negative or -doubtful. Establishment of a doubtful region reduced the number of sera otherwise classified as positive (false-positive sera). In this way, the sensitivity, specificity and agreement values were respectively 87.5%, 92.4% and 88.5%. No significant differences were observed in these values when the group vaccinated with cell-culture vaccine and the group vaccinated with suckling-mouse-brain vaccine were compared. It was shown that much of the disagreement between the values obtained by neutralization test and ELISA occurred in sera obtained at the beginning of the immunization process, and was probably due to the presence of IgM in the serum samples, detected only by the former test. This ELISA method can be used as a screening test in rabies laboratories regardless of the kind of vaccine used for immunization.

Este estudo apresenta resultados preliminares de títulos de anticorpos neutralizantes (AcN) obtidos em diferentes dias durante imunização anti-rábica humana empregando o esquema 2-1-1 (uma dose administrada em cada deltóide no dia 0, e uma dose nos dias 7 e 21), recomendado pela OMS para tratamento pós-exposição com vacinas de cultivo celular. Um esquema variante (dose dupla no dia zero e outra no dia 14) também foi testado; em ambos esquemas utilizamos a vacina produzida em cérebro de camundongos recém-nascidos. Obteve-se taxa de soroconversão total após 3 doses de vacina, e quase todos os pacientes (11 de 12) apresentaram títulos maiores que 1,0 UI/ml. Tanto os títulos de anticorpos neutralizantes como a taxa de soroconversão foram menores no grupo que recebeu apenas 3 doses, independentemente do dia da coleta de soro. Embora nossos resultados tenham sido inferiores àqueles encontrados com vacinas de cultivo celular, a média geométrica de AcN foi inteiramente satisfatória, sobrepondo o limite mínimo de 0,5 UI/ml recomendado pela OMS. O esquema 2-1-1 pode ser alternativa para tratamento pré-exposição: mais curto que o esquema clássico 3 + 1 (uma dose nos dias 0, 2, 4 e 30) e com apenas três idas ao médico, ao invés de quatro.

This study reports preliminary results of virus neutralizing antibody (VNA) titers obtained on different days in the course of human anti-rabies immunization with the 2-1-1 schedule (one dose is given in the right arm and one dose in the left arm at day 0, and one dose is apllied on days 7 and 21), recommended by WHO for post-exposure treatment with cell culture vaccines. A variant schedule (double dose on day zero and another on day 14) was also tested, both employing suckling mouse brain vaccine. A complete seroconversion rate was obtained after only 3 vaccine doses, and almost all patients (11 of 12) presented titers higher than 1.0 IU/ml. Both neutralizing response and seroconversion rates were lower in the group receiving only 3 doses, regardless of the sample collecting day. Although our results are lower than those found with cell culture vaccines, the geometry mean of VNA is fully satisfactory, overcoming the lower limit recommended by WHO of 0.5 IU/ml. The 2-1-1 schedule could be an alternative one for pre exposure immunization, shorter than the classical 3+1 regimen (one dose on days 0, 2, 4 and 30) with only three visits to the doctor, instead of four.

O esquema de imunização anti-rábica pré-exposição mais comumente utilizado no Brasil é o chamado 3+1, com emprego de vacina produzida em tecido cerebral de camundongos recém-nascidos (3 doses em dias alternados e uma dose no dia 30). Embora tenham sido obtidos bons resultados em grupos experimentais bem controlados com este esquema de vacinação, no Laboratório de Sorologia do Instituto Pasteur, São Paulo, são encontrados, com frequência, resultados inferiores a 0,5 Ul/ml de anticorpos neutralizantes. Estudamos o esquema pré-exposição 3+1 em condições de campo, em diferentes cidades do Estado de São Paulo, em condições variáveis e talvez adversas, tais como a utilização de diferentes lotes de vacinas, com diferentes títulos, entregues, estocadas e administradas nas condições locais. Cinquenta das 256 amostras de soro (19,5%) apresentaram títulos inferiores a 0,5 UI/ml, sem que houvesse, no entanto, uma distribuição homogênea entre as cidades estudadas. Enquanto em algumas cidades os resultados foram amplamente satisfatórios, em outras quase 40% deles deixaram de atingir o nível mínimo desejável. Os resultados aqui apresentados, se considerados isoladamente, tornam questionáveis nossos procedimentos atuais de vacinação anti-rábica humana pré-exposição. As razões determinantes desta situação são discutidas no trabalho.

The currently used pre-exposure anti-rabies immunization schedule in Brazil is the one called 3+1, employing suckling mouse brain vaccine (3 doses on alternate days and the last one on day 30). Although satisfactory results were obtained in well controlled experimental groups using this immunization schedule, in our routine practice, VNA levels lower than 0.5 IU/ml are frequently found. We studied the pre-exposure 3+1 schedule under field conditions in different cities on the State of São Paulo, Brazil, under variable and sometimes adverse circumstances, such as the use of different batches of vaccine with different titers, delivered, stored and administered under local conditions. Fifty out of 256 serum samples (19.5%) showed VNA titers lower than 0.5 IU/ml, but they were not distributed homogeneously among the localities studied. While in some cities the results were completely satisfactory, in others almost 40% did not attain the minimum VNA titer required. The results presented here, considered separately, question our currently used procedures for human pre-exposure anti-rabies immunization. The reasons determining this situation are discussed.

A Reação de Hemaglutinação por Imunoaderência foi padronizada de maneira simplificada, para detecção de anticorpos rábicos em soros humanos. Esta reação mostrou grande reprodutibilidade, maior que a apresentada pela clássica prova de soroneutralização em camundongos (SN). Ambas as provas mostraram alto grau de correlação, ou seja, altos títulos em uma reação correspondeu a altos títulos na outra; o mesmo ocorreu em relação aos títulos baixos. A reação de Hemaglutinação por Imunoaderência, além de ser de execução extremamente simples e rápida, tem custo bem menor se comparada a provas como a soroneutralização ou a imunofluorescência indireta. Pode, portanto, serde grande utilidade em laboratórios com poucos recursos ou mesmo ser utilizada como uma prova de triagem para a titulação de anticorpos rábicos.

In the present work the immune adherence hemagglutination test (IAHA) was standardized in a simplified procedure. This test showed good reproducibility, better than the classical mice serum neutralization test (SN). The tests showed high correlation degree: high titers in one test corresponded to high titers in the other one, and the same occured with low titers. The IAHA test is extremely simple, fast to perform, and of low cost when compared to tests such as SN or indirect immunofluorescense (IIF). It also proved to be useful in less sophisticated laboratories or even as a screening test for the titration of rabies antibodies.

O objetivo do presente trabalho foi estudar um novo esquema de vacinação anti-rábica humana, com um menor número de doses, administradas em dias não consecutivos (5 doses nos dias 0, 4, 7, 20 e 35). A avaliação da resposta imune humoral foi feita pela prova de soroneutralização e pela reação de imunofluorescência indireta, enquanto que a resposta imune celular foi avaliada pela transformação linfoblástica em cultura de sangue total e pelo teste cutâneo de leitura tardia. Foram estudados um total de 35 voluntários, submetidos ao esquema reduzido de vacinação, e os resultados encontrados permitem afirmar que, embora o número de casos seja relativamente pequeno, este novo esquema de vacinação mostrou-se capaz de induzir a produção de imunoglobulinas anti-rábicas, bem como de eli-citar a resposta imune celular ao antígeno rábico.

The present study evaluates the humoral and cellular immune responses in 35 volunteers submited to short antirabies vaccination schedules with the Fuenzalida & Palacios vaccine based on the administration of doses on non consecutive days. The volunteers were divided into two groups. The first group received a total number of five doses given on days 0, 4, 7, 20 and 35. The other group received four doses, the first one being a double dose given on day 0 and than three other single doses on days 7, 20 and 35. The evaluation of humoral immune response was carried out by serum neutralization (SN) and indirect immunofluorescense (IIF) tests, while the cellular immune response was evaluated by lymphoblastic transformation assay (LTA) and skin test (ST). According to our results these reduced schedules elicited early and effective humoral and cellulafimmune responses to rabies antigen suggesting that new reduced schedules should be extensively studied in order to give the proper bases to the proposition of changes in the current long-term schedule.

Foi estudada a ocorrência de resposta imune celular na re imunização anti-rábica humana. Usou-se a vacina Fuenzalida & Palácios a qual é rotineiramente usada no Brasil. A resposta imune celular foi avaliada pelo índice de transformação blástica obtido em cultura de sangue total, na presença de antígeno rábico e antígeno controle (sistema nervoso) . O grupo em estudo constitui se de 11 voluntários submetido a re vacinação, enquanto três outros, submetidos a primo-vacinação foram utilizados como grupo controle. Detectou-se uma clara resposta imune celular secundária contra antígeno rábico em todos os voluntários revacinados, cujas respostas foram mais rápidas e mais intensas do que as do grupo controle. Observou-se também, resposta ao antígeno controle em todos os indivíduos do grupo de revacinados. No grupo de primovacinados, resposta ao antígeno controle foi fracamente observada em somente um indivíduo.

The occurrence of secondary cell mediated immune response (CMI) in human antirabies immunization was studied. The Puenzalida & Palácios vaccine was used because it is routinely used in Brazil. CMI was evaluated by lymphoblastic transformation indices obtained in whole blood culture in the presence of rabies and control (nervous tissue) antigens. Eleven volunteers submitted to revaccination constituted the group under study, while three other volunteers submitted primo vaccination were utilized as control group. A clear secondary CMI to rabies antigen was detected in all the revaccinated volunteers who showed earlier and more intense response than the control group. Response to the control antigen, however, present in all the components of the first group was not detectable in two out of the three primovaccinated and very low in the third one.